Blog de las Plantas Carnívoras

El cultivo de tejidos, también conocido como la micropropagación, es un método de propagación utilizado para reproducir las plantas bajo condiciones estériles. Este método utiliza explantes de plantas (partes de la planta) o de las semillas que han sido esterilizadas antes de colocarse en recipientes con un medio de cultivo al que se ha añadido algunos nutrientes.

El término cultivo in vitro es un término muy genérico que se refiere más bien a la metodología usada que al propio objetivo de ese método. En sentido estricto, in vitro quiere decir “dentro de vidrio”, es decir, el cultivo de plantas o de alguna de sus partes (pero también de células y tejidos animales) dentro de recipientes de vidrio en condiciones de ambiente controlado. En las siguientes secciones nos referiremos siempre al cultivo in vitro aplicado a las plantas, omitiendo otros usos de esa técnica.

Existen otros términos cuyo significado se solapa parcialmente con el significado de cultivo in vitro:

Cultivo de tejidos vegetales: se refiere al cultivo in vitro de partes de la planta (tejidos o frecuentemente órganos)

Micropropagación: se usa para referirse a la utilización de las técnicas de cultivo in vitro aplicadas a la propagación vegetativa de plantas.

La micropropagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas por  la ingeniería genética. Se utiliza también la micropropagacion para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.

Muchos tipos de semillas germinadas en estas condiciones tienden a crecer muy rápido en comparación a ser sembradas en los medios de comunicación estándar cada vez más fuera de los contenedores estériles, cerrados. Uso de tejido de la planta, es posible crecer copias exactas de la planta donante. Esto es muy útil para las plantas que genéticamente tienen características deseables debido a que uno puede crear muchos clones de una planta en particular mucho más rápido que los métodos de propagación tradicionales como cortes, tirones o divisiones.

Lo normal es que los explantes, las semillas, los contenedores y el medio hayan sido esterilizados previamente para evitar contaminaciones.

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donante de yemas, durante un período que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades

Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta: sin agua y nutrientes minerales una planta no puede vivir ni in vitro ni in vivo. También se debe añadir azúcares al medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotróficas cuando se desarrollan en estas condiciones.

Los medios de cultivo estériles por lo general contiene una solución de nutrientes (por lo general sales y vitaminas), sacarosa (azúcar), las hormonas (opcional), antibióticos (opcional), y un agente de la solidificación o gelificantes como el agar (un producto de algas marinas).

Cuatro etapas del cultivo de tejidos vegetales han sido definidas por un pionero en el campo científico, Toshio Murashige, profesor emérito de la Universidad de California en Riverside:

* Etapa I. Establecimiento de un aséptico (estéril) la cultura.
* Etapa II. La multiplicación de los propágulos (un propágulo es parte de una planta utilizada para hacer o convertirse en nuevas plantas).
* Etapa III. Preparación de propágulos para una transferencia exitosa en el suelo (raíces y el “endurecimiento” (aclimatación) fuera de las condiciones estériles en regular los medios de cultivo).
* Etapa IV. Establecimiento en el suelo (o de otro medio de cultivo apropiado).

La diferencia principal entre el cultivo de tejidos y propagación por esquejes hecho, divisiones o semillas es que las plantas crecen más rápido (el medio de gel nutritivo ayuda) y uno puede multiplicarse rápidamente. En teoría, se puede crear un número infinito de las plantas de una sola pieza de tejido, y muchas plantas en un período relativamente breve de tiempo. A continuación se muestra una imagen, cortesía de Jens Brettschneider, mostrando la diferencia en la tasa de crecimiento y tamaño de la planta de semillas comenzó al mismo tiempo, a la izquierda en el cultivo de tejidos, ya la derecha en los medios de comunicación tradicionales macetas.

EL MEDIO DE CULTIVO:

Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

De manera general, el medio de cultivo debe ser rico en elementos minerales, en particular el potasio debe estar en un nivel alto para una mejor multiplicación vegetativa; desde este punto de vista, el medio Murashige y Skoog es conveniente.

Los meristemos se cultivan generalmente sobre medio sólido, aunque en algunos casos se utilizan medios líquidos (empleando puente de papel). El pH normalmente se sitúa entre 5,4-6,0. El contenido de sacarosa es de un 2-4%. Frecuentemente se utilizan las siguientes vitaminas: vitamina B1, piridoxina, ácido nicotínico y ácido pantoténico. Los reguladores que se suelen utilizar en bajas concentraciones (0,1-0,5 mg l-1); son auxinas y citoquininas para promover la división celular; el GA3 es mucho menos utilizado.

LA TEMPERATURA:

a temperatura a la que está expuesto el explanto cultivado in vitro afecta a la mayoría de procesos fisiológicos y por consiguiente es un factor fundamental a controlar.

En general, cada especie tiene un intervalo de temperaturas en el que se produce el crecimiento óptimo. Este intervalo puede variar en función del genotipo, del órgano del que se ha obtenido el explanto, de la época del año, de la edad de la planta madre, del fotoperíodo, etc. Una complicación adicional se produce por el hecho de que puede existir interacción entre la temperatura óptima de crecimiento y otros factores como la luz, la composición del medio (p.e: en algunos casos se ha comprobado que se obtiene mayor rendimiento haciendo fluctuar la temperatura según el fotoperíodo)

Determinar la temperatura óptima de crecimiento para cada cultivo in vitro puede ser un proceso muy laborioso que, además, exige gran cantidad de cámaras de cultivo reguladas de forma diferente. Afortunadamente, y para la mayoría de situaciones, se pueden obtener resultados satisfactorios con temperaturas de incubación que oscilan entre los 20 y 28⁰C.

El control de la temperatura no es solamente importante porque pueda afectar al crecimiento del cultivo sino también porque puede ser un factor que induzca determinados procesos fisiológicos. Así, temperaturas bajas (del orden de 4-5⁰C) permiten superar los periodos de dormición de algunas leñosas y la conservación prolongada de determinados cultivos in vitro; mientras que una temperatura constante de 20⁰ C induce la formación de raices en la mayoría de coníferas.

LA LUZ:

La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los organismos autótrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en los cultivos in vitro.

La luz es esencial para las plantas debido a que proporciona la energía necesaria para la fotosíntesis. La clorofila y los demás pigmentos fotosintéticos captan la energía contenida en diferentes radiaciones para incorporarla a las diversas reacciones químicas que constituyen el proceso. Pero la luz tambien puede intervenir en otros procesos fisiológicos, como el fototropismo, la germinación, la floración.

Se asume que las necesidades de luz de los cultivos in vitro son inferiores a las de la planta in vivo, dado que el medio de cultivo contiene cantidades importantes de sacarosa, los cultivos in vitro se comportan sólo parcialmente de forma autotrófica. Además, una irradiación excesiva produciría un aumento notable de la temperatura dentro del recipiente de cultivo debido al efecto invernadero.

EL FOTOPERÍODO:

Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas (germinación, floración, tuberización,…) pueden ser activados por el número de horas diarias de luz que recibe la planta. De forma análoga, el número de horas de luz que recibe el explanto cultivado in vitro puede afectar a su desarrollo. En general, el mejor fotoperiodo in vivo será también el mejor fotoperiodo in vitro.

FACE DE ACLIMATACIÓN:

Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantos o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada. La elección de un sustrato con buenas características físicas, es clave para el éxito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena turba, cáscara de arroz quemado , para permitir un desarrollo y crecimiento de raíces muy rápido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de acuerdo a la especie con la que estamos trabajando. Luego de retirar cuidadosamente el agar de las raíces para evitar dañarlas, los plantines se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de sustratos seleccionada y cubiertos con nylon. Todos los días se debe controlar el nivel de humedad en las almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual, para mantener un ambiente húmedo a nivel del sustrato. A los 15 días del trasplante, se puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de menor calor( temprano en la mañana o en la última hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por día destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes del trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las plantas pueden permanecer destapadas. Las condiciones del cultivo in vitro , generan cambios en algunos aspectos anatómicos y fisiológicos de las plantas, por esta causa, durante la aclimatación, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrés y tener mayor tasa de sobrevivencia.